实验专栏丨发高分SCI， 不会免疫组化怎么行？

世界那么大，实验方法层出不穷，免疫组化可谓经典中的经典~

科研讨论群的老师说：想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？

中洪免疫组化小王子：“是这个理，今天我就豁出去，将我多年的心得和经验奉献给你了。

下面，请听我娓娓道来~

免疫组化实验流程

主要试剂配制

1、1xPBS 缓冲液：秤取 NaCl 8.0g, KCl 0.2 g, Na2HPO4- 12H2O 2.85 g,KH2PO4 0.24 g, 加双蒸水900ml溶解,调pH值至7.4,量筒定容至IL，高温高压灭菌后使用。

2、0.5%Triton X-100：取50ul Triton X-100加入10mlPBS中，然后放入37℃水浴锅溶解。

3、a柠檬酸盐储存液的配制:0.1 MA每升含柠檬酸21 g;0.1 M梓檬酸钠缓冲液B:每升含梓檬酸钠29.4 g。b梓檬酸盐工作液的配制：0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)：每升含A液19 mL、B液81 mL,加蒸馏水溶解,调pH值至6.0,量筒滴定至1L。 

烤片

实验方法

1.石蜡切片预处理准备

烤片:组织切片入放入65℃-75℃烤箱中烤1.5h；

脱蜡:切片在二甲苯放置10min更换二甲苯在放置10min；

水化:将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇和80%乙醇中、纯化水各5min。

2.切片抗原修复：将切片放入修复盒中加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)，高压锅加热到自动放气，两分离开热源自然冷却。弃去抗原修复液,将切片用PBS淋洗。

3.切片的打孔:0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min。

4.消除内源性过氧化物酶：将切片移入湿盒中加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗；

5.非特异性封闭：封闭PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

5.免疫反应：

一抗：水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（DDIT3 1：300，，GRP78 1：300、CASP121：200），放入湿盒，4℃孵育过夜。

滴加兔/鼠二抗工作液，室温孵育1h，PBS充分淋洗；

6.显色复染

DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS或自来水冲洗1分钟 ；
苏木精复染3分钟，盐酸酒精分化,反蓝；
自来水冲洗1分钟 脱水、透明、封片、镜检。

修复

经验总结

1、石蜡切片和冰冻切片的比较？

问题	石蜡切片	冰冻切片
优点	保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温	保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步
缺点	石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，	细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散 切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮
备注	要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

2、如何才能充分脱蜡？

1）切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；

2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天室温高，3-5 min 就已足够。如果在冬天，则脱蜡时间需要延长，10-20 min 或更长。

3）当天切的切片，烧烤 2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20 min，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果会更好。

2、一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃复温？

一方面，防止切片从 4ºC 直接放入 PBS 易脱片；另一方面，使抗原抗体结合更稳定。

3、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。

4、脱片产生的原因和如何防止脱片？

多聚赖氨酸玻片质量的问题、组织切的不好、组织的问题、没烤好、操作的时候甩的太猛了、修复的问题。

今日的免疫组化你学会了吗？实验中你都有碰到哪些问题或有趣的事？右下角留言告诉我们，中洪或许能帮助到你！

PS建议把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

博元君有话说

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